Hematología: TÉCNICAS Y MÉTODOS BÁSICOS.
TÉCNICAS Y MÉTODOS
HEMATOLÓGICOS BÁSICOS
AUTOMATIZADOS Y
MANUALES
Las técnicas para el recuento de las células sanguíneas reciben
el nombre de CITOMETRÍA HEMÁTICA.
Hasta hace 50 años estas técnicas se realizaban de forma
manual por medio de cámaras de recuento y pipetas desde entonces el empleo de
estas técnicas han ido disminuyendo y hoy en día (salvo en algunos casos)
prácticamente no se utilizan.
En este apartado se explicarán los métodos manuales y los
fundamentos de los métodos automatizados.
MÉTODOS MANUALES
Inicialmente para el recuento celular se utilizaban unas
cámaras o hemocitómetros, conocidos también como las cámaras de Neubauer.
En dicha cámara se deposita la muestra previamente diluida
con una solución la cual permite identificar las células que se desean contar y
destruye las otras que no contaremos. Antes de depositar la muestra diluida se
agita bien y se desechan las primeras gotas. Luego se deposita una gota, en el
borde de la cámara y el cubreobjeto, con una micropipeta o pipeta pasteur, se llenará por
capilaridad (tener precaución de que la cámara no rebalse). Se deja reposar
unos minutos (aproximadamente 2’) para que sedimenten las células y luego se
realiza el recuento con el microscopio en 40X.
Técnicas de recuento: A continuación, las técnicas
para cada tipo celular:
Las cámaras de Neubauer poseen dos retículos, el
conteo se hace solo en uno de ellos.
En la imagen de la izquierda se observa un
retículo y sus zonas de conteo según el grupo celular.
Recuento de leucocitos o glóbulos blancos:
Dilución: Se realiza con Liquido de Turk (ácido acético al
2%) y sería de la siguiente forma: 0.02 ml o 20 microlitros de sangre en 0.38 microlitros
de líquido de Turk. Este líquido lisa (rompe) los hematíes. Se le agrega unas
gotas de violeta de genciana para teñir los leucocitos ligeramente (azul
violeta pálido).
Técnica de recuento: Se debe utilizar para hacer el recuento
de leucocitos, los 4 cuadrados de cada punta del retículo de la cámara y en
cada uno de estos, los cuatro de cada esquina. Hago el recuento, los sumo y luego
se multiplican por 50. La unidad que se utiliza es por mm3.
Recuento de hematíes, eritrocitos o glóbulos rojos:
Dilución: Se utiliza liquido de Hayem (cloruro de mercurio
0.25 g, cloruro de sodio 0.50 g, y sulfato sódico 2.50 g en 100 ml de agua
destilada) este liquido destruye los leucocitos y mantiene intacto los hematíes.
Técnica de recuento: se utiliza el cuadrante central del
retículo, en el cual se cuentan 16 cuadrados pequeños de cada esquina y 16 de
la parte central. El recuento total lo multiplico por 10.000. Se expresa en
mm3.
Recuento de plaquetas:
Dilución: se utiliza como liquido de dilución oxalato amónico
al 1% (1 g en 100 ml de agua destilada) que destruye eritrocitos. Seria con las
siguientes cantidades: 0.02 ml o 20 microlitros de sangre en 1.98 ml o 1980
microlitros de oxalato amónico.
Técnica de recuento: Se utiliza el cuadrante central del retículo,
y el conteo se hace en 5 cuadrados (que a su vez poseen 16 cuadrados pequeños)
superiores e inferiores. El conteo total lo multiplico por 40.000. Se expresa
en mm3. Se deben contar mínimo 100 plaquetas.
Posibles errores por medio de este método:
·
Errores personales:
-
Toma de muestra incorrecta (muestra hemolizada,
coagulada)
-
En el llenado de la cámara,
-
En la dilución de la muestra,
-
En el conteo de células.
·
Errores instrumentales:
-
No comprar materiales de calidad,
-
No limpiar y conservar la cámara correctamente.
·
Errores inherentes a la técnica:
-
Relacionados con el conteo de células y la
distribución de células.
Limpieza de la cámara:
La
cámara y el cubreobjeto se deben limpiar en agua templada inmediatamente después
de su uso. Se frotan con un paño sin hilos y se deja secar al aire.
Las superficies no se deben tocar con gasa o lino porque estos
materiales pueden rayar la superficie de conteo.
Líquidos disolventes:
Se
pueden refrigerar. Al momento de utilizar se deben filtrar y desechar lo que no
se utilizó.
Recuento de reticulocitos:
Este recuento no se
hace en la cámara de Neubauer. Se realiza sobre un extendido de sangre. Para
su detección se necesitan colorantes que precipitan el ARN que contienen estos
glóbulos rojos inmaduros, para luego observarse al microscopio.
Dilución y tinción: se colocan en tubo de ensayo o de Khan partes
iguales de sangre con EDTA y el colorante azul de cresil brillante o azul de metileno
al 1% (3 gotas de sangre con EDTA + 3 gotas del colorante), se homogeniza, deja
en reposo a temperatura ambiente o 37°C durante 15 minutos. Se vuelve a homogenizar,
se realiza un extendido. Se deja secar al aire.
Técnica de recuento: se observa el extendido al microscopio
con objetivo de inmersión (100x). En los reticulocitos se observará una
granulación o basófilia que corresponde al ARN, que se tiñe de azul oscuro, y un
citoplasma azul pálido. Los glóbulos rojos maduros se verán de color azul
pálido o verde azulado.
El porcentaje de reticulocitos es en base a una cierta
cantidad de eritrocitos, se deben contar al menos 500 eritrocitos en total y contabilizar
cuantos reticulocitos se observaron en base a este conteo. A continuación, un
ejemplo de como hacerlo:
Y luego se procede a calcular el porcentaje de
reticulocitos: 11/500 x 100= 2.2%
También se puede calcular realizando una regla de tres:
Los valores del porcentaje de reticulocitos se modifican
significativamente a temperatura ambiente por lo tanto debe procesarse preferentemente
antes de las 3 horas de extraída la muestra.
MÉTODOS
AUTOMATIZADOS
Se fundamentan en los principios de impedancia eléctrica
y dispersión de la luz. Detectan la
variación volumétrica de partículas
y variación óptica por difracción, respectivamente.
Impedancia eléctrica: desarrollado por los Coulter en
1947 consiste en la detección volumétrica por variación de la impedancia
(corriente eléctrica) lo que permite la transformación del volumen de las
células en señal eléctrica.
Las células no son buenas conductoras de energía eléctrica,
por lo tanto, cuando una célula, suspendida en una disolución electrolítica, atraviesa
una ranura por la que pasa una corriente eléctrica se produce una variación de
la resistencia eléctrica que se cuenta como un pulso de voltaje.
El equipo puede realizar dos operaciones: conteo de los impulsos
y medida del volumen de cada partícula contada proporcional a la amplitud del
impulso de corriente.
Dispersión de la luz, detección óptica o citometría de
flujo: este método consiste en el pasaje de la sangre por un microcanal que
es atravesado por un haz de luz transversalmente.
Cuando ese haz de luz es interrumpido por el paso de una célula
se genera una dispersión que varía según el volumen y tamaño de la célula. Esto
es detectado por una célula fotoeléctrica en la que las variaciones de la
intensidad luminosa son transformadas en señales eléctricas.
Posibles errores:
En cualquiera de los métodos pueden
presentarse un falso conteo por presencia de:
-
Partículas similares en tamaño a las distintas células.
-
Mala calidad de las muestras (coagulación parcial)
-
Trastornos hematológicos: crioglobulinas (aumento de glóbulos blancos)
-
Paso de varias células de manera simultánea:
altera conteo y volumen celular. (ejemplo: glóbulos rojos o plaquetas
aglutinadas alteran HCM y CHCM)
Determinación de índices en autoanalizadores:
Los equipos automatizados detectan los cinco parámetros clásicos
del hemograma: glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas, hematocrito,
hemoglobina, formula leucocitaria y tres parámetros complementarios que son:
VCM, HCM Y CHCM, los índices hematimétricos ya visto en un capítulo anterior,
son calculados por un programa:
-
El VCM se establece por el volumen y tamaño
detectado por la magnitud de la señal (fl: femtolitros)
-
La HEMOGLOBINA se determina luego de la dilución
de la muestra en un medio que produce la lisis de los glóbulos rojos,
utilizando un método donde se mide la intensidad del color de la reacción (método
de la cianometahemoglobina).
-
El HEMATOCRITO se establece por calculo a partir
del VCM y numero de glóbulos rojos. Comparado con el método manual, es siempre
un 3% mas bajo ya que no se tiene en cuenta el plasma que se encuentra en los
glóbulos rojos.
-
El HCM Y CHCM se determinan por medio de cálculos
utilizando los parámetros ya medidos: hemoglobina, hematocrito y glóbulos
rojos.
Los equipos automatizados se caracterizan por:
·
Preparación automática de las diluciones a
partir de la sangre tomada por un dispositivo de alta precisión:
-
Una dilución para el conteo de glóbulos rojos y
plaquetas
-
Una dilución para el conteo de glóbulos blancos
que produce la lisis de glóbulos rojos y que a su vez permite la determinación
de concentración de hemoglobina.
·
Presencia de dos circuitos de análisis independientes:
1.
Leucocitos – hemoglobina
2.
Hematíes – plaquetas
·
La hemoglobina se mide después de la lisis de
los hematíes y su transformación en cianometahemoglobina. La lectura es colorimétrica.
·
Se realizan tres mediciones y el cálculo promedio
es el resultado que se reporta.
·
Contienen un flujo hidrodinámico que mantiene
las células ya contadas fuera de la zona sensible para evitar un segundo
conteo. (citometría de flujo)
·
Para cada parámetro se memorizan en el equipo
los valores de referencia.
Los equipos mas modernos han
implementado, para mayor sensibilidad y especificidad:
·
Laser de semiconducción que aumenta la precisión
de las mediciones, optimiza reactivos, reduce costos y aumenta durabilidad.
·
Sistema de enfoque hidrodinámico: permite
evaluar glóbulos rojos y plaquetas individualmente en una sola fila generando
recuentos de alta precisión.
·
Citometría de flujo para el extendido que
minimiza la necesidad de la verificación manual, identifica y reporta células
inmaduras y tiene un alto desempeño.
·
Tinciones fluorescentes automáticas para el
recuento de reticulocitos.
·
Para determinación de formula sanguínea se están
implementando todos los métodos conocidos a la vez (luz de dispersión, citometría
de flujo, impedancia, fluorescencia) con el fin de lograr la mayor precisión
posible para la determinación de la cantidad y calidad de todas las células
circulantes en sangre periférica.
Histogramas:
La mayoría de los analizadores hematológicos generan dos
tipos de datos: gráficos (para revisión interna del laboratorio) y numéricos (para
entregar a los solicitantes).
Los resultados gráficos se representan en forma de
histogramas, donde se representa el número relativo de hematíes, leucocitos y
plaquetas frente al tamaño celular, y en forma de gráficos dispersivos o citogramas, donde se sitúan
las subpoblaciones leucocitarias.
En esta imagen observamos un histograma de eritrocitos
obtenido por el principio de impedancia eléctrica. A la izquierda se observa el
«cuerpo del histograma» y a la derecha el «dedo del histograma», que corresponde
a células que cuenta más grandes de lo que son, debido a que pasan juntas a través
de la apertura.
En esta imagen se observa un histograma obtenido
por el principio de enfoque hidrodinámico. La población de células (eritrocitos)
se agrupa mejor que con la impedancia eléctrica y el «dedo del histograma» desaparece,
como resultado de no contar células que pasan juntas y «engañan al instrumento».
Cambios en el histograma de eritrocitos generados por la
presencia de crioaglutininas.
Algunas alteraciones del histograma de eritrocitos y su
relación con el volumen corpuscular medio y el ancho de distribución de los
eritrocitos.
Histograma de eritrocitos con población
microcítica; en este caso, el volumen corpuscular medio corresponde a 68,3 fL y
el ancho de distribución de los eritrocitos a 15,3%.
Histograma con población macrocítica; en este caso, el
volumen corpuscular medio corresponde a 114,3 fL y el ancho de distribución de los
eritrocitos a 18,3%.
Histograma dimórfico. En este caso, el paciente
tenía una anemia ferropénica (hemoglobina 8,2 fL, Volumen corpuscular medio 62,5
fL y ferritina 1ng/mL), se trató con suplemento de hierro y
tres meses después de iniciar el tratamiento, se normalizaron la hemoglobina y
las constantes corpusculares (hemoglobina 13,6 g/dL, hematocrito 41%, volumen
corpuscular medio 80,1 fL, concentración media de hemoglobina corpuscular 33,2
g/ dL). Como resultado del tratamiento exitoso, en el histograma de eritrocitos
coexisten dos poblaciones, una correspondiente a los eritrocíticos microcíticos
residuales y la segunda a eritrocitos de tamaño normal.
Gráfico dispersivo o Citograma de leucocitos de un paciente con recuento diferencial de leucocitos normal.
En el panel de la izquierda, el citograma muestra cuatro poblaciones de leucocitos: linfocitos (L), monocitos (M), neutrofilos y basófilos (N + B) y eosinófilos (E). En el panel de la derecha, el citograma complementario muestra dos poblaciones: neutrófilos (N) y basófilos (B).
Sysmex® XE-2100.
De las pipetas y la cámara de Neubauer a la impedancia
eléctrica y al láser óptico.
En el contexto de la calidad, el médico como usuario
final del servicio, espera que el laboratorio le provea resultados cada vez más
precisos, exactos, oportunos y de utilidad clínica. La automatización y la robótica
han contribuido para que el laboratorio clínico alcance este objetivo y una de
las pruebas más representativas en este aspecto ha sido el hemograma. Los
procesos que hoy tienen estas características parten de 1956 cuando se inicia
la comercialización de los primeros instrumentos para el recuento de células
sanguíneas, instrumento que se desarrolló gracias al ingeniero Wallace Coulter,
quien en 1949 inventó el contador de células basado en el cambio que éstas
producen al pasar por un orificio que separa dos medios con diferentes
potencias eléctricas, principio que se conoce como el de la resistencia
eléctrica o de la impedancia o también como principio Coulter. Pero no fue sino
hasta finales de la década de los 70 cuando los equipos empezaron a mostrar
cambios en el perfil del hemograma con la incorporación del volumen corpuscular
de los glóbulos rojos. A este avance se le sumó a partir de 1980 la tecnología
de flujo continuo que permitió la medida de la dispersión de la luz, lo cual se
transformó en el citómetro de flujo, cuya complejidad, parámetros y eficiencia
han ido evolucionando en una forma progresiva, lo siguen haciendo y seguirán,
de eso estemos seguros.
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